Phage Display

 Qué es phage display?

Phage display es una técnica innovadora que se utiliza para seleccionar péptidos, proteínas o anticuerpos de una gran colección de fagos que exponen en sus superficies distintos péptidos, proteínas o anticuerpos.  Esta colección de fagos se les llama genoteca, librería o biblioteca de péptidos, proteínas o anticuerpos.

• Péptidos son seleccionados de una librería de péptidos o biblioteca de péptidos.  Por ejemplo, de una librería de péptidos como la librería Ph.D. ™-C7C de New England Biolabs, la cual expresa en la superficie de fagos péptidos de 7 o 12 aminoácidos (más información sobre estas librerías de péptidos podrás encontrarla en la página http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp).

• Proteínas de interés son seleccionadas de una librería de proteínas o biblioteca de proteínas. Por ejemplo, de una librería de proteínas que exponen, a su vez, proteínas de un microorganismo en la superficie de fagos con la finalidad de seleccionar proteínas con cierta función o afinidad a otra proteína conocida. Podemos  mencionar el trabajo realizado por la doctora K. Jacobsson y su sistema Shotgun Phage display. Este sistema consiste en exponer de forma multivalente proteínas o dominios de proteínas de microorganismos a través de la proteína pVIII de la cápsida de los fagos filamentosos. El ADN genómico del microorganismo es digerido y clonado al azar en fusión con la proteína pVIII de la cápsida del fago (Comb Chem High Throughput Screen. 2001 Apr; 4(2):135-43.). En otros sistemas de phage display también se han expuesto proteínas y dominios proteicos en la cápsida de fagos filamentosos en fusión con la proteína pIII.

• Anticuerpos son seleccionados de una genoteca, librería o biblioteca de anticuerpos. Phage display está ampliamente utilizada en la selección de anticuerpos. Los anticuerpos no son expresados en el fago en forma de una inmunoglobulina entera sino en forma de fragmentos Fab o scFv. Por ejemplo, las librerías de anticuerpos de Morphosys AG (http://www.morphosys.com) y Dyax Corp (http://www.dyax.com) son una de las librerías de anticuerpos que están siendo utilizadas para este propósito.

La selección se hace a través de varios pasos de selección llamados panning o biopanning.

Historia de phage display

George P. Smith es considerado el padre de la técnica phage display.  Smith demostró en 1985 que manipulando el genoma de los fagos se podía obtener partículas con péptidos fusionados a proteínas de su cápsida o superficie (Science 1985, 228(4705): 1315-1317).  Posteriormente Smith escribió un artículo con el Dr. Valery Petrenko explicando detalladamente esta nueva tecnología (Chem Rev. 97 (2): 391-410). Estos artículos científicos aportaron los cimientos para trabajos posteriores en esta área científica.

Principio básico de phage display

La tecnología, técnica o sistema phage display consiste en exponer péptidos, proteínas o anticuerpos en la superficie de partículas de fagos. Una característica importante de este sistema es la vinculación de la proteína (péptido o anticuerpo) expresada en la superficie de un fago al gen que la codifica mediante la fusión del gen de esta proteína (péptido o anticuerpo) al gen que codifica una proteína de la cápsida del fago como la proteína pIII o pVIII.   Las partículas de fagos que presentan proteínas (péptidos o anticuerpos) en sus superficies pueden ser seleccionadas con una diana de interés (por ejemplo un antígeno) inmovilizada en la superficie de un inmunotubo o acoplada a partículas magnéticas. La diana tiene que tener cierta afinidad a la proteína expuesta en la superficie del fago para capturar aquellos fagos que tengan la proteína en su superficie. Todas las partículas de fagos que no se unan  a la diana de interés son eliminadas mediante sucesivos lavados. Las partículas de fagos capturados son eluidos primeramente y después son utilizadas para infectar E. coli y permitir la amplificación de estos fagos para ser utilizados en un nuevo ciclo de selección. De esta forma, se puede seleccionar de una gran población de fagos que expresen péptidos, proteínas o anticuerpos monoclonales en su superficie uno o varios clones que se unan de forma específica a una diana de interés. Los pasos de selección son llamados panning o biopanning, y es necesario tener una librería de péptidos (también llamada biblioteca de péptidos) cuando se quiere seleccionar un péptido de interés, una librería de proteínas (también llamada biblioteca de proteínas) cuando se quiere seleccionar una proteína de interés o una librería de anticuerpos (también llamada biblioteca de anticuerpos o genoteca de anticuerpos) cuando se quiere seleccionar anticuerpos frente a un antígeno de interés.

Aplicaciones de la técnica phage display

Phage display se puede utilizar para:

• Seleccionar proteínas, péptidos o anticuerpos monoclonales con afinidad a una diana de interés.

• Inmortalizar anticuerpos producidos por líneas celulares de hibridomas que crecen de forma inestable.

• Identificar molecular que se internalizan en células eurcariotas.

• Identificar epítopos, mimotopos, sitios accesibles y/o funcionales de diferentes antígenos (Mol Inmunol 1986; 23:709-15).

• Identificar modificaciones postraduccionales de moléculas diversas (Science. 1993; 260:1113-7).

• Estudiar la especificidad de la fosforilación de tirosinas y de las interacciones proteína-proteína mediada por fosfotirosina.

• Diseño de vacunas. Phage display puede facilitar la identificación de estructuras peptídicas con aplicaciones potenciales en la prevención de enfermedades, por ejemplo mediante la pesquisa de bibliotecas de péptidos, tanto con anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos de patógenos, como con sueros de interés. También los fagos filamentosos pueden ser empleados como inmunógenos, es decir, inmunizando con fagos que sean portadores de péptidos derivados de proteínas de patógenos como Plasmodium falciparum (J Biol Chem 1988;263:4318-22).

Una de las aplicaciones más importantes de phage display es la obtención de anticuerpos monoclonales.

Selección de anticuerpos a través de phage display

Phage display es un sistema alternativo al sistema clásico de obtención de anticuerpos monoclonales llamado técnica de hibridomas. La diferencia entre los dos sistemas es que con phage display no es necesario inmunizar ratones si se utiliza una librería “naïve de anticuerpos” (más informacion sobre librería naïve de anticuerpos la puedes encontrar en la página anticuerpos monoclonales o librería de anticuerpos). Una población de fagos que exponen distintos anticuerpos en sus superficies y que reconocen diferentes epítopos de un mismo antígeno equivale a anticuerpos policlonales. Un clon de fago que expone solamente un anticuerpo en su superficie es equivale a un anticuerpo monoclonal. Más información sobre la técnica de hibridomas la podrás encontrar en la página anticuerpos monoclonales y sobre la obtención de anticuerpos a través de phage display en la página tecnología phage display y librería de anticuerpos.